Kuo skiriasi toksiškumas ir ekotoksiškumas?

Žinios apie nuodų vartojimą, o tuo pačiu ir su tuo susiję eksperimentų (dažnai su kriminaliniu taikymu) duomenys kaupiami nuo neatmenamų laikų. Tačiau šiuolaikinė toksikologija pirmiausiai sprendžia vaistų pramonės keliamus uždavinius, t. y. aiškinasi, kiek žmogui pavojingi nauji vaistai ir jų deriniai. Tam naudojami specialūs modeliai – eksperimentiniai gyvūnai (testorganizmai), pagal kurių reakciją į tiriamus vaistus galima prognozuoti ir poveikį žmogui. Žmogus nėra įtrauktas į eksperimentinių gyvūnų sąrašą, o bioetikos reikalavimai labai riboja netgi eksperimentus su aukštesniaisiais gyvūnais. Farmacijos tikslais dar ir dabar kamuojama daug artimų mūsų giminaičių – žmogbeždžionių. Tačiau žmogus – ne vien biologinis individas, bet ir gyvosios gamtos atstovas ir, deja, agresyvus jos ir savo gyvenamosios aplinkos keitėjas. Todėl, nuo XX a. vidurio daugėjant žalingos žmogaus veiklos įrodymų, vystantis mokslinei įrangai ir atskyrus medicinos krypties tyrimus nuo toksikologinių, atsirado ekotoksikologija – mokslas, tiriantis toksinių medžiagų (dažniausiai antropogeninės kilmės) tiesioginį poveikį gyviesiems organizmams (išskyrus žmogui) ir netiesioginį poveikį per mitybos ryšius šioms medžiagoms migruojant ir kaupiantis gyvuosiuose organizmuose, taip pat ir negyvuosiuose aplinkos komponentuose, pvz., dugno nuosėdose. Taigi, tiriant toksikanto poveikį kuriam nors organizmui, atliekamas toksikologinis tyrimas, o tiriant jo poveikį sąveikaujantiems ekosistemos elementams – ekotoksikologinis tyrimas, padedantis prognozuoti ekosistemų pokyčius.

Daugėjant naujų sintetinamų medžiagų (tarp jų ir nanomedžiagų), kurios patekusios į aplinką didina teršalų kiekį, skursta augalų ir gyvūnų rūšių įvairovė. Todėl vienas iš ekotoksikologijos tikslų – įvertinti galimus antropogeninio poveikio aplinkai padarinius, įskaitant tiesioginį ir netiesioginį poveikį pačiam žmogui. Pastaruoju metu skelbiama, kad ekologinės problemos žmonijai kelia didesnę grėsmę, nei karai. Jie nublanksta prieš Brazilijos ar Sibiro miškų niokojimą, galintį sukelti globalių klimato pokyčių (Gore 2008). Šiame straipsnyje plačiau nagrinėsime artimiausios gamtinės ir buitinės aplinkos objektus, galinčius daryti neigiamą poveikį ekosistemai, aptarsime vandens toksiškumo tyrimus. Vandeniui pirmenybę teikiame dėl jo vaidmens gyvosios ir negyvosios gamtos procesuose ir ūkinėje žmogaus veikloje. Tikrai ne veltui sakoma, kad vanduo – tai gyvosios gamtos, suvokiamos kaip superorganizmas, kraujas.

 Vandens kokybė chemiko ir biologo akimis

Vandens kokybė nėra griežtai apibrėžta. Ilgokai buvo manoma, kad tarša nekelia pavojaus, jei neviršijama kiekvienam toksikantui nustatyta riba – didžiausioji leidžiamoji koncentracija (DLK). Toksinių medžiagų arba bent tam tikrų cheminių medžiagų grupių DLK skiriasi. Šitoks vertinimas patogus ir suprantamas. Jis ypač tinka, kai reikia kontroliuoti tam tikruose technologiniuose procesuose panaudotus ir išvalytus vandenis. Deja, šis rodiklis netinka nežinomų medžiagų mišinių, pvz., pramonės ir buitinių nuotekų mišinių, patenkančių į hidroekosistemas, toksiškumui vertinti. Yra žinoma, kad toksikantų mišinio poveikis gali skirtis nuo pavienių jo komponentų suminio poveikio, nes kai kurios medžiagos mišinyje stiprina arba silpnina kitų veikimą. Taigi, apie tokio mišinio pavojingumą reikėtų spręsti pagal jo poveikį organizmui, audiniams, ląstelėms ir kt. Vaizdžiai tariant, reikėtų pačių hidrobiontų paklausti, kokia vandens tarša jiems jau pavojinga. Juk sveiko proto žmogus nesiryžtų maistui vartoti vandens, kurio tinkamumas argumentuojamas vien tuo, kad nei vienos iš dešimčių jame rastų kenksmingų medžiagų koncentracija neviršija DLK.

 Kam tiek skirtingų biotestų?

Pagrindinis ekotoksikologijos įrankis – biotestas – būdas įvertinti cheminės medžiagos ar jų mišinio toksiškumą pasitelkus gamtoje paplitusį bandomąjį gyvūną, augalą ar mikroorganizmą (kartais pakanka ir jų fragmento). Pasaulyje biotestai plačiai taikomi praktiškai. Šiuo metu gana daug biotestų yra standartizuoti ir priimti Tarptautinės standartų organizacijos (International Organization for Standartization, ISO), JAV Gamtos apsaugos agentūros (United States Environmental Protection Agency, USEPA), Vokietijos standartizacijos instituto (angl. German Institute of Standartization, DIN). Lietuvoje naudojami biotestai atitinka LST standartus [1]. Biologinių toksiškumo tyrimų rinka kai kuriose šalyse išsivystė tiek, kad ekotoksikologinius tyrimus daro ne tik valstybinės, bet ir privačios laboratorijos. Tad pereinama prie masinio standartizuotų ir patogių biotestų naudojimo.

Ekotoksikologiniams tyrimams naudojamus biotestus galima suskirstyti pagal jų taikymo sritį. Viena jų – vandens monitoringas, t. y. nuolatinis vandens kokybės kitimo stebėjimas. Naujausi tiesioginio monitoringo metodai leidžia be pertrūkio registruoti, pvz., upės vandens būklę. Stebimajame telkinyje organizmas‑biomonitorius reaguoja į vandens kokybės pokyčius, o įdiegtos ryšių sistemos praneša apie vandens kokybės pablogėjimą. Bene patikimiausia tiesioginio monitoringo sistema pratekančio vandens kokybei stebėti yra pagrįsta Dreissena polymorpha elgesiu – geldelių atsidarymu ir užsidarymu, priklausančiu nuo fizinių ir cheminių vandens savybių. Tokie biomonitoriai ypač naudingi įgyvendinant nacionalines ekosistemų atkūrimo programas, kaip antai Šv. Lauryno upės kartu su Didžiaisias ežerais Š. Amerikoje, sudarančiais vieną didžiausių pasaulyje gėlojo vandens rezervuarą, ar Reino Vokietijoje ir Olandijoje. Lietuvoje tokios, pvz., yra eršketų ir lūšių populiacijų atkūrimo programos, kurias vykdant į gyvūnus įterpiamos mikroschemos, leidžiančios nustatyti jų migraciją. Tiesiogiai vandens kokybei kontroliuoti pasitelkiami ir kiti organizmai: bakterijos, dumbliai, vėžiagyviai, žuvys.

Dar viena biotestų taikymo sritis – išsamesni eksperimentiniai vandens kokybės tyrimai. Taikomi metodai sudėtingesni ir brangesni, nei naudojami tik vandens kokybei stebėti, o tyrimai dažniausiai atliekami laboratorijose. Vandens mėginiai analizei imami griežtai pagal nustatytą metodiką, laikomasi griežtų tiriamojo organizmo kultivavimo ir jo jautrumo palaikymo sąlygų, poveikis vertinamas pagal standartizuotą procedūrą.

Kiti svarbūs tyrimai, kuriems naudojami biotestai, – bioindikatoriniai. Jiems pasitelkiami natūraliai toje aplinkoje gyvenantys organizmai. Šie tyrimai atliekami lauko arba laboratorinėmis sąlygomis, pvz., nustatoma augalų rūšinė sudėtis, žuvų ar moliuskų audiniuose sukauptų sunkiųjų metalų ar radioaktyviųjų elementų koncentracija.

Be įprastų cheminių vandens kokybės rodiklių, vandens toksiškumui vertinti biotestai valstybinės aplinkosaugos mastu pradėti taikyti Š. Amerikoje. 1973–1978 m. įdiegti vaivorykštinių upėtakių biotestai. Siekta taip išvalyti nuotekas, kad upėtakiai išgyventų bent keturias dienas (XX a. 6‑ojo dešimtmečio pabaigoje dauguma nuotekų Š. Amerikoje dar nebuvo valomos!). Taip buvo žengtas pirmasis žingsnis vertinant vandens taršą biologiniu aspektu. Dabar pirmaujančiose Europos šalyse taikomos biologinės kontrolės sistemos, kuriose dažniausiai naudojami mikrobiotestai. Tai jautrūs ir nebrangūs vandens toksiškumo įvertinimo metodai, kuriuos taikant tyrimų rezultatai gaunami greitai. Mikrobiotestams naudojami mikrodumbliai, bakterijos, pirmuonys ir nedideli vėžiagyviai, todėl reikia mažiau medžiagų ir laboratorinio triūso. Kitaip nei biotestams, kuriems keliami bioetikos reikalavimai, mikrobiotestais galima vertinti toksinį poveikį nustatant tiriamųjų organizmų, pvz., vėžiagyvių, mirtingumą. Toks rezultatas nors ir labai aiškus, tačiau atspindi tik paskutinę apnuodijimo stadiją, besibaigiančią žūtimi. Nenorint likti tik juodaisiais metraštininkais, reikėtų pastebėti ankstyvesnius nuodų veikimo požymius. Tam tiriami normalių fiziologinių reakcijų pokyčiai ir nustatoma, pvz., pakitusi gyvūnų elgsena, biomasės ar augimo spartos sumažėjimas.

Dar išsamiau įvertinti taršą galima kartu pasitelkus biologinės ir cheminės analizės metodus. Taip atskleidžiami skirtingi toksinio veikimo aspektai: gyvojo organizmo atsakas parodo taršos poveikio buvimą, o cheminė analizė suteikia informacijos apie taršos kilmę ir galimą biologinio poveikio priežastį. Šiuo keliu pasukta XX a. pab. siekiant nustatyti į aplinką patenkančias pavojingas medžiagas, pvz., chlorfenolio darinius medžio apdorojimo gamyklų nuotekose. Kai kuriose šalyse, pvz., Švedijoje, JAV, Kanadoje, taikomos kelių etapų pavojingumo vertinimo schemos: jei po pradinio biotestavimo etapo paaiškėja, kad taršos pavojingumas nėra didelis, išvengiama brangesnių tyrimų. Dar patogiau, jei kelių etapų eksperimentinis vertinimas apibūdinamas bendru kiekybiniu indeksu (savotišku pažymiu).

  Lietuvoje atliekami biotestai

Lietuvoje valstybinė vandens kokybės kontrolė atliekama pagal cheminius rodiklius, palyginant išmatuotą toksinės medžiagos koncentraciją mėginyje su DLK. Visos aplinkos taršą tiriančios institucijos vertina toksinių medžiagų DLK. Mūsų šalyje biologiniai metodai nuotekų kontrolei dar netaikomi, tačiau Lietuvos mokslininkų pastangos jau nukreiptos šia linkme. Pagal reikalą atliekami žuvų – vaivorykštinių upėtakių Salmo gairdneri ir žiobrių Vimba biotestai, gėlavandenių vienaląsčių žaliųjų dumblių, aukštesniųjų vandens augalų Spirodela polyrrhiza ir Lemna minor augimo slopinimo biotestai, įvairių vėžiagyvių – dafnijų, krevečių, sūriavandenių artemijų ir bentosinių organizmų Heterocypris incongruens biotestai. Besivystant biotestams daugėja testorganizmų rūšių, kurių kiekviena suteikia kokybinės informacijos apie ekosistemos tam tikros grandies būseną. Tačiau gyvųjų organizmų reakcija į toksikantų poveikį priklauso ir nuo organizmų rūšies, ir nuo toksinės medžiagos. Todėl norint kiekybiškai įvertinti galimą žalą naudojamas biotestavimo metodų rinkinys. Paprastai bent vienas iš metodų yra greitasis diagnostinis metodas, atspindintis subletalų (nesukeliantį žūties) ūmų toksiškumo poveikį. Labiausiai standartizuotas ir daugelio šalių aplinkosaugos sistemoje naudojamas ūmaus toksiškumo MICROTOX biotestas, pagrįstas bakterijų Photobacterium phosphoreum bioliuminescencijos (švytėjimo) pakitimu per 15 minučių. Jis priskiriamas naujai biotestų kartai, nes naudojamos bakterijos yra liofilizuotos (sausos), o biotestas visiškai automatizuotas. Lietuvoje sukurtas greitasis metodas kenksmingų medžiagų poveikiui vertinti pagal augalo ląstelės elektrofiziologinį atsaką. Jo atskaitos taškas (angl. endpoint) – žvaigždėtojo maurašakio Nitellopsis obtusa ląstelės membranos 50 proc. depoliarizacija veikiant toksikantui per 90 minučių. Šis metodas išskirtinai jautrus nuotekų poveikiui. Be to, ši ląstelės membranos reakcija pasireiškia anksčiau, nei žūsta pati ląstelė, o jei toksikantų poveikis nebūtų pašalintas – po 4–8 dienų ji žūtų.

Apžvelgėme nedidelę dalį šiuo metu ekotoksikologijos arsenale esančių biotestavimo metodų. Kiekvienas jų suteikia daugiau informacijos, nei vienos cheminės medžiagos nustatymas vandenyje, tačiau juos atlikus nesužinoma, kokia visai hidroekosistemai daroma žala. Ir apskritai, kas yra tinkamas žalos ekosistemai matas? Akivaizdu, kad jis ne toks vienareikšmis, kaip ilgio ar masės matas, nors ir ne toks subjektyvus kaip grožio ar turto. Į šį klausimą ekotoksikologija dar negali tiksliai ir vienareikšmiškai atsakyti. Siekiant kiekybiškai įvertinti nuotekų ar cheminės medžiagos kenksmingumą, nustatoma jų koncentracija, kuriai esant žūsta 50 proc. tiriamųjų gyvūnų (letali, kitaip – mirtina, koncentracija; LC50) arba 50 proc. pakinta (dažniausiai sumažėja) stebimo požymio dydis (efektyvioji koncentracija, EC50). O kaip prognozuoti mėginio kenksmingumą ekosistemai? Tam reikėtų naudoti ne vieną, o keletą biotestų. Vertindami toksikanto žalą turime atsižvelgti į nepalankų jo poveikį pagrindinėms vandens ekosistemos mitybos grandims ir įvertinti ūminį, ilgalaikį ir genotoksinį veikimą. Kuo daugiau biotestų, tuo tiksliau atspindimas poveikis ekosistemai. Tačiau siekiant mažesnių tyrimų išlaidų, naudojamas mažiausias biotestų rinkinys, dar suteikiantis pakankamai informacijos. Patogu, jei atskirų biotestų rodmenis apibendrintų vienas, juos susiejantis matas, leidžiantis palyginti vieną mėginį su kitu (vieną toksikantą su kitu). Kanados ir Prancūzijos mokslininkai pasiūlė tokį nuotekų toksiškumo vertinimo kriterijų – PEEP indeksą (angl. Potential Ecotoxic EffectProbe; Costan ir kt. 1993). Jis apskaičiuojamas pagal biotestų rinkinio kiekybiškai išreikštus atsakus. Apskaičiuojant atsižvelgiama į nuotekų srautus ir jų biologinį skaidymą. Tikimasi, kad ateityje šis ar kitas skaitmeninis indeksas bus taip pat reikšmingas ir visiems suprantamas, kaip žemės drebėjimo stiprumo apibūdinimas pagal Richterį.

Lietuvoje nemažai padaryta, kad mokslininkų, aplinkosaugininkų ir koordinuojančių institucijų sutelktos pastangos ekotoksikologinių tyrimų srityje remtųsi šiuolaikiniu mokslo lygiu. Per keletą pastarųjų metų buvo parengta įstatymų, standartų ir kitų dokumentų projektų, o svarbiausia – pasiūlyta nuotekų kontrolės, pagrįstos biotestais, sistema, suderinta su dabar Lietuvoje galiojančia cheminio vertinimo ideologija. Jai įdiegti praktikoje betrūksta politinės valios.

 Kadangi jau susipažinote su biotestavimo galimybėmis, siūlome atlikti svogūnų šaknelių augimo slopinimo biotestą ir pabandyti atsakyti į straipsnio pavadinime iškeltą klausimą: vandenie, kam tu geras, o kam – ne.

 Reikalavimai tyrėjui

Smalsumas, eksperimentatoriaus kruopštumas ir sveikas protas.

 Tyrimo tikslas

Tyrimo tikslas – įvertinti gamtinės ir antropogeninės kilmės vandeninių terpių toksiškumą.

Uždaviniai

Taikant svogūnų (Allium cepa) biotestą ištirti:

• geriamojo vandens (iš vandentiekio ar šulinio) poveikį;
• medžių lapų nuokritų ekstraktų toksiškumą;
• nuorūkų ekstraktų toksiškumą;
• buitinių nuotekų toksiškumą.

 Tyrimo metodika

Tyrimo esmė

Veikiant augalą toksinėmis medžiagomis, taip pat tirpalu, kurio pH netinka šiam augalui arba kuriame yra netirpių medžiagų, galinčių trukdyti maisto medžiagoms patekti į augalą, slopinamas augalo šaknelių augimas. Tiriamojo tirpalo pH turi būti 4–10. Jei tirpale gausu biogenų (N, P, K), jis gali skatinti šaknelių augimą ir veikti ne kaip nuodas, o kaip trąša.

Nedidelės svogūnų galvutės auginamos mėgintuvėliuose ar nedidelio skersmens stiklainiuose (į juos įdedama po kartono skridinėlį su kryžmine įpjova svogūno galvutei fiksuoti), į kuriuos įpilta tiriamojo tirpalo. Allium cepa svogūnų tyrimas atliekamas kambario temperatūroje (apie 20 °C) apsaugant juos nuo tiesioginių Saulės spindulių. Paprastai kontrolinės ir tiriamosios svogūnų grupių šaknelių augimo skirtumas išryškėja po 48–72 valandų. Tiriamosios medžiagos toksiškumo stiprumas įvertinamas išmatavus kiekvienos grupės visų svogūnų šaknelių ilgį ir apskaičiavus jo vidurkį. Augančių šaknelių apeksai gali įgyti kabliuko, spiralės ar gumbo pavidalą (Fiskesjö 1988), o tai rodo esant specifinį tiriamosios medžiagos poveikį.

Tiriamųjų tirpalų toksiškumas augalams įvertinamas pagal svogūnų (Allium cepa) šaknelių vidutinį prieaugį per 72 val. (pagal Fiskesjö 1993).

Tiriamieji augalai, auginimo terpės, priemonės

 Tiriamieji augalai

 Tyrimams atrenkamos vienodo dydžio, apie 1,5 cm skersmens svogūnų (Allium cepa L.) galvutės. Jų reikės iki 100 vienam tyrimui.

•  Auginimo terpė

Mikrokomponentai:

Nesant galimybės pasigaminti auginimo terpės, vietoj jos galima naudoti distiliuotą vandenį arba kokybišką vandentiekio (šulinio) vandenį, t. y. jo pH turi būti apie 7, kalcio ir magnio jonų kiekis 50–70 mg/l, jame neturi būti didelė koncentracija, pvz., vario jonų, patekusių į vandenį iš vamzdyno, ar aliuminio jonų, pasitaikančių šulinio vandenyje, kurio pH mažas. Naudojant vandentiekio vandenį kaip auginimo terpę, būtina prieš jį surenkant iš čiaupo leisti vandenį bent 3 minutes. Pasaulio sveikatos organizacija rekomenduoja, kad vario jonų koncentracija geriamajame vandenyje būtų ne didesnė kaip 0,05 mg/l. Esant didesnei koncentracijai kaip tik ir registruojami Allium šaknelių augimo sutrikimai (Fiskesjö 1988).

Ekstraktų ruošimas

Lapų nuokritų ekstraktas (pagal Krevš ir kt. 2013). Surinktos lapų nuokritos atskiriamos nuo šakų ir šiukšlių, išdžiovinamos ir susmulkinamos. Lapų nuokritų masė dedama į indą su auginimo terpe (100 g sausos masės/l). Kratykle kratoma 48 val., po to filtruojama per popierinį filtrą.

Nuorūkų vandeninis ekstraktas (pagal Micevska ir kt. 2006). Dešimt vienos rūšies cigarečių nuorūkų su filtru dedama į 1 l talpos stiklinį ar plastikinį butelį, iki 75 proc. pripildytą auginimo terpės. Kratykle kratoma 24 val., po to filtruojama per popierinį filtrą.

Nuorūkų vandeninis etanolinis ekstraktas ruošiamas kaip nuorūkų vandeninis ekstraktas, tik prieš tai paruošiamas auginimo terpės ir etanolio tirpalas (30 ml/l etanolio arba proporcingą kiekį degtinės).

Buitinės nuotekos surenkamos atsukus virtuvės plautuvės sifoną (nepamirškite po sifonu pastatyti dubenį), po to filtruojamos per popierinį filtrą. Nuotekos iš sifono surenkamos po indų plovimo praėjus bent valandai.

Vandentiekio vanduo (jei naudojamas) tyrimui imamas iš vandentiekio čiaupo praėjus ilgesniam laiko tarpui po vandens nuleidimo, pvz., po nakties. Šiuo atveju kontrolinė terpė yra vandentiekio vanduo, surinktas prieš tai bent 3 minutes leidus vamzdynuose užsistovėjusį vandenį.

Tirpiklių naudojimas

Jei ekstraktams ruošti naudojami organiniai tirpikliai, reikalingi papildomi kontroliniai tyrimai tirpiklio poveikiui svogūnų šaknelių augimui nustatyti (metanolio ir etanolio koncentracija neturėtų viršyti 3–5 proc. tūrio vienetais). Šiems kontroliniams tyrimams naudojama tokia pati tirpiklio koncentracija, kaip ir ekstraktams ruošti, o toks tirpalas neturi pasižymėti toksiniu poveikiu.

Prieš tyrimą pradiniai koncentruoti tirpalai: lapų nuokritų, nuorūkų ekstraktai ir nuotekos, 10 kartų praskiedžiami auginimo terpe. Tirpalo pH turi būti apie 7 (jei pH mažesnis, į tirpalą pilama 1,0 M NaOH, jei didesnis – 0,1 mM HCl, kol gaunamas pH 7).

Pastaba. Kontrolei, ekstraktams gaminti ir skiesti naudojama ta pati terpė – tai gali būti auginimo terpė, vandentiekio vanduo arba distiliuotas vanduo (vietoj distiliuoto vandens galima naudoti virintą vandenį).

Priemonės:

• stikliniai maždaug 10 cm ilgio ir 1,5 cm skersmens mėgintuvėliai (tinka ir stiklainiai);
• filtravimo priemonės;
• stovai mėgintuvėliams;
• nedidelis aštrus peilis;
• liniuotė;
• fotoaparatas (jei norima nuotraukose užfiksuoti, kaip augo svogūnų šaknelės).

 Svogūnų paruošimas tyrimui

Laikymas

Iki tyrimo pradžios svogūnų Allium cepa galvutės laikomos sausai 10–20 °C temperatūroje. Taip svogūnus galima laikyti net ilgiau nei metus, kol atsiras naujas derlius. Tačiau dalis svogūnų gali perdžiūti arba juos gali pažeisti pelėsis, todėl patartina jų įsigyti 3–4 kartus daugiau, nei būtina numatytiems tyrimams atlikti. Tyrimams reikia atrinkti sveikus svogūnus.

Svogūnų savybės

Tyrimui naudojami Allium cepa svogūnai yra tam tikros genetinės populiacijos ir nėra klonai. Taigi, jų savybės šiek tiek skiriasi, o tai būdinga ir gamtiniams individams, augantiems natūraliomis sąlygomis. Tai šio biotesto pranašumas, nes svogūnus galima įsigyti turguje ar prekybos centre, nors ir ne visada aišku, ar jie nebuvo apdoroti herbicidais arba fungicidais. Net jei ir buvo, šių medžiagų poveikis neatsispindės tyrimo rezultatuose, nes jomis buvo apdoroti ir tiriamieji, ir kontroliniai svogūnai.

Tiriamųjų ir kontrolinės svogūnų grupių imtis

Vidutinis svogūnų šaknelių ilgis apskaičiuojamas išmatavus 10 svogūnų, paveiktų tam tikros koncentracijos tirpalu, šaknelių ilgį. Kiekvienoje svogūnų grupėje gali būti nedaigių svogūnų, taip pat tokių, kurių šaknelės blogai auga, pažeistų pelėsio, todėl tyrimui iš pat pradžių imamos 20 proc. didesnės kontrolinė ir tiriamosios svogūnų grupės, t. y. po 12 svogūnų. Po 1–2 dienų tolesniems tyrimams kiekvienoje grupėje paliekama 10 geriausiai augančių svogūnų. Kai turimas nedidelis kiekis tiriamojo tirpalo, kiekvienai grupei užtenka ir 5–6 svogūnų.

Tyrimo eiga

Nedideliu aštriu peiliu nulupami išoriniai gelsvai rusvi (sausi) svogūnų lukštai ir, jei įmanoma, nuo galvutės apačios, nepažeidžiant šaknelių užuomazgų lankelio, nupjaunamos likusios pernykštės nudžiūvusios šaknelės. Nuvalyti svogūnai dedami į indą su trupučiu vandens ir jame laikomi iki tyrimo pradžios.

Į stovus dedama po 12 mėgintuvėlių kontrolinei ir kiekvienai tiriamajai grupei. Kaip jau minėjome, vietoj mėgintuvėlių gali būti naudojami stiklainiai. Į kontrolinei grupei skirtus mėgintuvėlius pripilama auginimo terpės, o į tiriamųjų grupių – tam tikros koncentracijos tiriamųjų tirpalų, gautų skiedžiant auginimo terpe pradinį tirpalą.

Iš indo su vandeniu išimti svogūnai dedami ant minkšto popieriaus ar medžiagos, kad apdžiūtų. Po vieną svogūną dedama į mėgintuvėlį šaknelių užuomazgomis į apačią taip, kad jos šiek tiek panirtų į tirpalą.

Kontrolinės ir tiriamųjų grupių tirpalai mėgintuvėliuose pakeičiami po 24 ir 48 valandų. Taupant tiriamojo tirpalo galima nekeisti, bet į mėgintuvėlius įpilti tiek tirpalo, kiek jo išgaravo (0,5–1,0 ml).

Po 48 val. iš kiekvienos grupės pašalinama po du blogiausiai augančius svogūnus. Po 72 val. liniuote matuojamas visų svogūnų šaknelių kūlelių ilgis, nekreipiant dėmesio į labai ilgas ar trumpas šakneles (t. y. iš akies nustatomas šaknelių kūlelio vidutinis ilgis, 1 pav.). Dabar tyrimą galima būtų baigti, tačiau jei norima išsiaiškinti, ar toksikantų sukeltas poveikis grįžtamas, galima pakeisti penkių iš dešimties mėgintuvėlių tiriamuosius tirpalus auginimo terpe. Po 24 val. paprastai galima pastebėti, ar šaknelės geriau auga mėgintuvėliuose su pakeista terpe. Jei taip, toksikantų poveikis yra grįžtamas. Atkreipkite dėmesį, kurios koncentracijos tirpaluose prieš tai augintų svogūnų šaknelės pradėjo geriau augti, o kurios – jau ne.

1 pav. Svogūnų šaknelių kūlelio vidutinio ilgio matavimas liniuote: 1 – trumpiausios šaknelės, 2 – ilgiausios šaknelės, 3 – vidutinio ilgio šaknelės. Kūlelio ilgiu yra laikomas liniuote išmatuojamas dydis, apie kurį spiečiasi daugiausiai šaknelių. Ši padėtis nustatoma iš akies. Nuotrauka autorių

Efektyviosios koncentracijos (EC_x) nustatymas

Jei norima nustatyti, kokios koncentracijos tirpalas sukelia x proc. dydžio pokytį (EC_x), reikia atlikti tyrimus su bent penkių geometrine progresija mažėjančių, pvz., 100, 50, 25, 12,5 ir 6,25 proc., koncentracijų tirpalais. Tai leidžia įvertinti EC_x su pasirinktu pasikliautinuoju lygmeniu. Ne mažiau kaip viena gauta slopinimo reikšmė turi būti mažesnė ir viena didesnė, nei numanomos EC_x reikšmės x dydis procentais, bei trys slopinimo reikšmės turėtų skirtis nuo 0 ir 100 proc. Priešingu atveju pasikliautinasis intervalas gali būti pernelyg didelis augimo skirtumams patikimai pagrįsti.

Tam tikros koncentracijos toksikanto poveikio nustatymas

Jei tik norima išsiaiškinti, ar tam tikros koncentracijos tirpalas slopina svogūnų šaknelių augimą, tyrimams užtenka tik tos vienos koncentracijos tirpalo. Tiriamąją ir kontrolinę grupes turi sudaryti vienodas kiekis svogūnų.

 Duomenų pateikimas ir rezultatų interpretavimas

EC₅₀apskaičiavimas

Apskaičiuojamas kontrolinės ir kiekvienos tiriamosios grupės svogūnų šaknelių vidutinis ilgis. Tada kiekvienos tiriamosios grupės svogūnų šaknelių augimo slopinimas kontrolės atžvilgiu (procentais) apskaičiuojamas pagal lygtį:

S_i = [(L_k–L_i)/L_k] × 100,

čia

S_i –  šaknelių augimo slopinimas (proc.);

L_k – kontrolinės grupės svogūnų vidutinis šaknelių ilgis (cm);

L_i –  tiriamosios grupės svogūnų vidutinis šaknelių ilgis (cm) veikiant i koncentracijos tirpalu.

Mėginio toksiškumui apibūdinti ekotoksikologijoje plačiai taikomas efektyviosios koncentracijos, esant x atsako lygiui, rodiklis EC_x, randamas modeliuojant toksikanto koncentracijos ir atsako priklausomybę. Tam naudojami netiesinės regresijos metodai, įdiegti specialiose kompiuterio programose, pvz., „Statistica“, SPSS, „Origin“.Tyrimo metu būtina gauti daug įvairių atsako reikšmių, kad būtų galima įvertinti visus toksikanto koncentracijos ir atsako priklausomybės parametrus. Pavyzdžiui, jei priklausomybė išreiškiama monotoniškai didėjančia „S“ formos funkcija, ji apibūdinama silpniausio ir stipriausio atsako parametrais ir funkcijos nuolydžio parametru. Norint teisingai įvertinti šiuos parametrus, reikalingi atsako į toksikanto koncentraciją, sukeliančią mažiausią, didžiausią ir bent 2–3 tarpinio didumo atsako lygius, duomenys. Ekotoksikologai sutaria, kad geriausia tyrimams naudoti toksikantų tirpalus, kurių koncentracija skiriasi pastoviu daugikliu (koncentracijos geometrinė seka).

Naudojant programą „Origin“ efektyviajai koncentracijai nustatyti pagal toksikanto koncentracijos ir atsako priklausomybę (2 pav.), kaip nepriklausomasis kintamasis yra toksikanto koncentracija, išreikšta dešimtainiu logaritmu, o kaip priklausomasis kintamasis – tam tikros koncentracijos tirpalų sukeltas šaknelių augimo slopinimas, išreikštas procentais. Pirmiausia pasirenkama, kaip duomenys bus vaizduojami: Plot:Symbol:Scatter. Toliau pasirenkama funkcija, pvz., „Logistic“ (Analysis:Fitting:Fit Sigmoidal:Open Dialog box:Settings:Function:Logistic:Fit), ir programa nubrėžia „S“ formos kreivę. Rekomenduojama užfiksuoti logistinės funkcijos asimptočių (horizontalių tiesių, prie kurių artėja kreivė jų nekirsdama) vertes (Analysis:Fitting:Fit Sigmoidal:Open Dialog box:Parameters). Kadangi tyrimai buvo atlikti su keliomis labai skirtingomis toksikantų koncentracijomis, visuomet bus nustatoma, kad tam tikros koncentracijos tirpalai neslopina šaknelių augimo, todėl apatinę logistinės priklausomybės asimptotę A1 galima laikyti nuliu (2 pav., lentelė). Viršutinę asimptotę galima laikyti šimtu tada, kai didžiausio slopinimo reikšmė yra artima 100 proc. Viršutinė asimptotė nefiksuojama, jei ji nedaug viršija 50 procentų. Programa pateikia EC₅₀ įvertį ir jo standartinę paklaidą.

Kai didžiausios koncentracijos tirpalas neslopina daugiau kaip 50 proc., registruojamas didžiausias nustatytas šaknelių augimo slopinimas procentais, pvz., neskiestas mėginys slopina 40 proc. šaknelių augimą.

2 pav. EC50 koncentracijos apskaičiavimas programa „Origin“

 Pakartoti eksperimentą su kiekvienos koncentracijos tirpalais būtina dėl įvairių priežasčių, pvz., jei suabejojama svogūnų kokybe ir vienodumu, įtariama tyrimo metu buvus nekontroliuojamų veiksnių (artefaktų). Apskritai, toksikanto koncentracijos ir atsako priklausomybei nustatyti geriau ištirti daugiau įvairios koncentracijos tirpalų poveikį, o ne didinti tiriamąją grupę sudarančių organizmų skaičių (Allium svogūnų biotesto atveju, ypač jei netiriamas poveikio grįžtamumas, vietoje 10 svogūnų galima tirti 5–6 svogūnų šaknelių augimą).

Literatūra

Al Gore, Nepatogi tiesa, Obuolys, Vilnius, 2008, 192 p.

Costan G., Bermingham N., Blaise C., Férard J. F. 1993, Potential ecotoxic effects probe (PEEP): A novel index to assess and compare the toxic potential of industrial effluents. Environmental Toxicology and Water Quality, 8 (2), 115–140, http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/tox.2530080202/abstract

Fiskesjö G. 1993, Allium test I: A 2–3 day plant test for toxicity assessment by measuring the mean root growth of onions (Allium cepa L.). Environmental Toxicology and Water Quality, 8 (4), 461–470, http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/tox.2530080410/abstract

Fiskesjö G. 1988, The Allium test – an alternative in environmental studies: the relative toxicity of metal ions. Mutation Research, 197 (2), 243–260, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0027510788900966

Krevš A., Darginavičienė J., Gylytė B.  ir kt. 2013, Ecotoxicological effects evoked in hydrophytes by leachates of invasive Acer negundo and autochtonous Alnus glutinosa fallen off leaves during their microbial decomposition. Environmental Pollution, 173, 75–84, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0269749112004265

Micevska T., Warne M. St. J., Pablo F., Patra R. 2006, Variation in, and Causes of, Toxicity of Cigarette Butts to a Cladoceran and Microtox. Archives of Environmental Contamination and Toxicology, 50 (2), 205–212, http://link.springer.com/article/10.1007%2Fs00244-004-0132-y

Kai kurios sąvokos

Antropogeninis poveikis – žmogaus veiklos poveikis gamtinei aplinkai.

Apeksas – šaknelės ar ūglio viršūnė.

Atsakas – biologinio rodiklio reikšmės pokytis dėl patirto poveikio.

Atsako lygis – tam tikra išmatuota arba iš anksto numatyta atsako reikšmė procentais, palyginti su kontrole.

Atskaitos taškas (angl. endpoint) – toksiškumo įvertis, gautas atsižvelgus į biologinį rodiklį, atsako lygį ir poveikio trukmę, pvz., svogūnų šaknelių ilgio slopinimas kontrolės atžvilgiu 50 proc. per 72 val.

Biogenai – gyviesiems organizmams būtini cheminiai elementai.

Biologinis rodiklis – organizmo ar jo substruktūrų funkcinės būsenos išraiška, pavyzdžiui, gyvūno judrumas, dumblių augimo greitis, organizmo žūtis, bakterijų švytėjimas ir kt.

Biota – visa, kas gyva ekosistemoje, iš dalies hidroekosistemoje – vandens biota, apimanti vandens ekosistemoje gyvenančius organizmus.

Biotestas – biologinis metodas, skirtas kiekybiškai ar kokybiškai įvertinti mėginio toksiškumą stebint tiriamojo organizmo ar jo substruktūrų atsaką į poveikį.

Biotestų rinkinys – biotestų grupė ekotoksiškumui nustatyti.

Efektyvioji (veiklioji) koncentracija (EC_x) – mėginio koncentracija, sukelianti tiriamųjų organizmų ar jo substruktūrų x proc. atsako lygio pokytį. Ši koncentracija išreiškiama tūrio procentais ir nustatoma iš toksikanto koncentracijos ir tiriamojo organizmo atsako priklausomybės.

Ekotoksikologinis tyrimas – mėginio (cheminių medžiagų, nuotekų, sąvartyno filtrato, telkinio vandens ar bet kurios sudėties vandeninės terpės) toksinio poveikio vandens biotai nustatymas biotestu ar biotestų rinkiniu.

Hidrobiontai – vandenyje gyvenantys organizmai.

Ląstelės membranos depoliarizacija – išorinės terpės ir ląstelės vidaus elektrinio potencialo skirtumo (normaliomis sąlygomis jis neigiamas, menturdumblių ląstelių iki –200 mV) pakitimas link nulio.

Letali (mirtina) koncentracija (LC_x) – mėginio koncentracija, sukelianti x proc. tiriamųjų organizmų žūtį. Ši koncentracija išreiškiama tūrio procentais ir nustatoma iš toksikanto koncentracijos ir tiriamojo organizmo atsako priklausomybės.

Lėtinis toksiškumas – mėginio savybė sukelti lėtinį tiriamojo organizmo atsaką ilgalaikio poveikio (paprastai jis sudaro daugiau nei 10 proc. organizmo gyvenimo trukmės) metu (dienos, savaitės, mėnesiai). Lėtinis atsakas dažnai siejamas su augimo, vystymosi ir vislumo sutrikimais.

Makrokomponentai – vyraujantys cheminiai elementai ir junginiai.

Mėginys – dalis žinomos ar nežinomos cheminės sudėties vandens, paimto (eko)toksikologiniam tyrimui.

Mėginio ekotoksiškumas – ekotoksikologiniais tyrimais nustatoma mėginio savybė, tikėtinai kenksmingai paveiksianti vandens biotą, toksikantams patekus į vandens telkinį.

Mikrokomponentai – cheminiai elementai ir junginiai, kurių objekte (mėginyje, terpėje ir kt.) yra labai mažai.

Pasikliautinasis intervalas – dydžio verčių intervalas, kuriame su pasirinktąja tikimybe gali būti matavimo rezultato vertė.

Regresija – vieno atsitiktinio dydžio vidurkio priklausomybės nuo kito (ar kitų) dydžio išraiška. Tai procedūra, kai randami tikrinamo modelio parametrai, kad jo prognozės būtų kuo artimesnės duomenims.

Subletalus poveikis – poveikis, nesukeliantis žūties.

Testorganizmai – augalai, gyvūnai, mikroorganizmai ar atskiri jų fragmentai, naudojami aplinkos ar kitam poveikiui įvertinti.

Toksikantas – gamtinės arba antropogeninės kilmės nuodingoji medžiaga.

Toksiškumo įvertis – apskaičiuota mėginio efektyviosios ar letalios koncentracijos reikšmė.

Ūminis toksiškumas – mėginio savybė sukelti greitą tiriamojo organizmo atsaką trumpalaikio poveikio (paprastai jis sudaro mažiau nei 10 proc. organizmo gyvenimo trukmės) metu (minutės, valandos ar keletas dienų).

[1] Lietuvoje taikomus standartus galima rasti http://www.lsd.lt/index.php?-865714984