Iveta Varnagirytė‑Kabašinskienė

Paprastoji pipirnė. Nuotrauka autorės

1 pav. Sėjamąsias pipirnes galima auginti įvairiuose substratuose (kairėje kaip substratas naudojamas filtravimo popierius, dešinėje – dirvožemis). Nuotrauka autorės

Nors Europoje šis iš pietvakarių Azijos kilęs vienametis augalas paplitęs, Lietuvoje natūraliai augančių pipirnių randama itin retai. Daugeliui pipirnės žinomos kaip ant palangės auginti tinkami prieskoniniai augalai. Jos greitai dygsta, auga, nėra reiklios substratui (gali augti net vandenyje), lengva atlikti matavimus, nes nėra aukštos. Aplinkos poveikis nustatomas palyginus kontrolinių ir tiriamųjų pipirnių sėklų daigumą, daigų išvaizdą, šaknų ilgį ir (arba) stiebų aukštį, augalų masę (Wang 1991, Wundram ir kt. 1997, Kupčinskienė ir kt. 1998). Tinkamomis sąlygomis augančių sėjamųjų pipirnių svarbiausi morfologiniai[2] požymiai: plunksniškai karpyti arba skiautėti lapai, balti arba rožiniai į žiedynus susitelkę maži žiedai, mažos, šiek tiek plokščios, gelsvai rudos, beveik lygiu paviršiumi sėklos.

Dirvožemio tyrimai. Sėjamosios pipirnės dažniausiai naudojamos oro, vandens ir dirvožemio taršos tyrimams. Vieni žalingiausių transporto ir pramonės teršalų yra sunkieji metalai. Jie kaupiasi dirvožemyje, augaluose ir keliauja mitybos grandine iki žmogaus. Didelės kadmio sankaupos dirvožemyje mažina pasėlių produktyvumą, o pastarieji nuodingi gyviesiems organizmams. Dirvožemio tarša sunkiaisiais metalais dažniausiai nustatoma cheminiais metodais, tačiau tam galima naudoti ir sėjamąsias pipirnes. Kai kadmio koncentracija dirvožemyje yra apie 100 mg/kg, sutrinka pipirnių fotosintezė, jos lėčiau auga (Gill ir kt. 2012). Neretai teršalai stiprina vienas kito poveikį. Pavyzdžiui, Czuba ir Ormrod (1981) nustatė, kad jaunesnius pipirnių lapus labiau veikė kadmis nei ozonas, tačiau šio metalo poveikį ozonas sustiprino. Bendras kadmio ir ozono poveikis sukėlė pipirnių daigų chlorozes (spalvos pokyčius) ir net nekrozes (audinių žūtį).

Auginimas kiminų terpėje. Kitas taršos tyrimo metodas – sėjamųjų pipirnių daiginimas ir auginimas kiminų terpėje (Karalytė 2007, Žilinskaitė 2014). Kaip nurodo Žilinskaitė (2014), kiminų terpėje auginamų pipirnių daigų vystymasis priklauso nuo kiminų sukauptų teršalų koncentracijos. Pramonės ir transporto taršos tyrimams kaip teršalus sugeriantis augalas gali būti naudojamas magelaninis kiminas (Sphagnum magellanicum). Substratas sėjamosioms pipirnėms auginti ruošiamas iš užterštoje aplinkoje surinktų ar tam tikrą laiką joje laikytų kiminų, pvz., iš užterštoje įmonės teritorijoje, miesto intensyvaus transporto zonose įvairiu atstumu nuo taršos šaltinio specialiuose maišeliuose ar tinkleliuose laikytų kiminų. Užterštoje aplinkoje kiminus galima laikyti nuo 3 savaičių iki 6 mėnesių (Kupčinskienė 2011).

Dumblo toksiškumo tyrimai. Pipirnes daiginant nuotekų dumble galima įvertinti dumblo fitotoksinį poveikį (kenksmingą poveikį augalams), kurį sukelia jame esantys amonio junginiai, sunkieji metalai, pesticidai, policikliniai aromatiniai angliavandeniliai ir kitos medžiagos (Fuentes ir kt. 2006, Oleszczuk 2008). Toksinio poveikio stiprumui įvertinti naudojamos tam tikros vertinimo skalės. Pavyzdžiui, Marčiulionienė ir Montvydienė (2002) nuotekų dumblo toksiškumą tyrė įvairiais bioindikatoriais, tarp jų ir sėjamąja pipirne. Tam buvo lyginami kontrolinių ir tiriamųjų sėjamųjų pipirnių rodikliai. Jei jie skyrėsi ne daugiau kaip 20 proc., laikyta, kad dumblas nepasižymi toksiniu poveikiu, jei 20–40 proc. – toksinis poveikis silpnas, jei 40–60 proc. – toksinis poveikis vidutinis, jei daugiau kaip 60 proc. – pasireiškia stiprus toksinis poveikis.

Lapų nuokritų toksiškumo tyrimai. Vieni įdomesnių tyrimų, kuriuose kaip bioindikatorius naudojamos sėjamosios pipirnės – medžių nuokritų toksiškumo tyrimai. Žinoma, kad po kai kurių rūšių medžių lajomis žoliniai augalai prastai auga arba visai neauga. Nėra vieningos nuomonės ir svarių mokslinių įrodymų, kokios priežastys tai lemia. Gali būti, kad žolinių augalų dygimą ir augimą slopina kai kuriuose augaluose ir medžių nuokritose esantys fenoliniai junginiai (Reigosa ir González 2006). Jie priskiriami alelochemikalams – medžiagoms, neigiamai veikiančioms augalų fiziologinius procesus. Šėžienė (2015) nurodo, kad alelochemikalai veikia augalų sėklų dygimą (jos prasčiau ir vėliau sudygsta) ir pirminį daigų augimą. Didelė alelochemikalų koncentracija augalus veikia neigiamai, o maža gali paveikti netgi teigiamai. Stipresnis alelopatinis poveikis (vienų augalų poveikis kitiems per įvairias jų išskiriamas medžiagas) pasireiškia augalams augant šalia vienas kito. Pavyzdžiui, Melkania (1992) nustatė, kad pūvančios lapų nuokritos slopina pipirnių sėjinukų augimą, užauginama mažiau biomasės. Palyginus įvairių augalų dalių poveikį pipirnėms, paaiškėjo, kad labiausiai jų augimą slopino žaliuose lapuose esančios medžiagos, silpniau – medžiagos, esančios lapų nuokritose ir medžių šakelėse (Melkania 1992, Djurdjević ir kt. 2005).

Dėl šiltėjančio klimato Lietuvoje vis labiau plinta svetimkraščių rūšių medžiai. Svetimkraštės rūšys – tai už natūralaus arealo ribų gyvenančios ir besidauginančios rūšys, dar vadinamos introdukuotomis, nevietinėmis, svetimžemėmis rūšimis. Svetimkraščiai medžiai itin greitai prisitaiko prie naujų sąlygų ir neretai išstumia vietinius žolinius ir sumedėjusius augalus. 2011–2012 m. Lietuvoje tirta, kaip svetimkraščių medžių lapai veikia pipirnių sėklų daigumą ir daigų vystymąsi (Viltrakytė 2012). Šiam tyrimui buvo pasirinktas europinis maumedis, paprastasis bukas ir raudonasis ąžuolas, kurių plotai Lietuvos miškuose šiltėjant klimatui, tikėtina, didės. Labiausiai pipirnių sėklų dygimą slopino raudonojo ąžuolo lapų nuokritos, o mažiausiai – paprastojo buko (2 pav.). Gali būti, kad pastarosiose nuokritose buvo daugiausia maisto medžiagų. Literatūroje nurodoma, kad raudonojo ąžuolo lapuose gausu fenolinių junginių, neigiamai veikiančių žolinių ir sumedėjusių augalų sėklų dygimą ir daigų augimą (Djurdjević ir kt. 2005).

2 pav. Sėjamųjų pipirnių sėklų daigumas (proc.) svetimkraščių medžių lapų nuokritų substrate. Parengta pagal Viltrakytė 2012.

Kimura ir kt. (2015) tyrė, kokį poveikį raudonosios pušies medynų paklotė daro augalams. Paaiškėjo, kad didesnės koncentracijos pušyno paklotės ekstraktai slopina pipirnių augimą. Tikėtina, kad šių medžių spygliuose esančios aktyviosios medžiagos neigiamai veikia ir kitų augalų augimą. Tačiau tai tik pirminis augalų nuokritų toksiškumo tyrimo etapas. Toliau reikėtų gilintis į gerokai sudėtingesnius biocheminius procesus.

Sodininkystės ir daržininkystės institute atliekami tyrimai su bioindikatoriais kintančios aplinkos sąlygomis. Tam naudojamos klimato kameros, todėl galima reguliuoti augalus veikiančius aplinkos veiksnius, pvz., apšvietimą, temperatūrą, anglies(IV) oksido, ozono koncentraciją. Nustatyta, kad kylant oro temperatūrai didėja pipirnių atsparumas ozono poveikiui (Brazaitytė ir kt. 2008). Šių tyrimų rezultatai svarbūs modeliuojant augalų reakciją į šiltėjantį klimatą. Jei kaip bioindikatorius naudojamos sėjamosios pipirnės, rezultatus galima gauti po keleto dienų, o jei sumedėję augalai – po 1–2 vegetacijos periodų[3] arba daugiau negu po pusantrų metų.

 Pasiūlymai jauniesiems tyrėjams

Jaunieji tyrėjai galėtų patyrinėti aplinkos (oro, dirvožemio, vandens, dumblo ir kt.) užterštumą kaip bioindikatorių naudodami sėjamąsias pipirnes. Su šiais augalais taip pat galima atlikti trąšų, cheminių medžiagų, buitinės chemijos (ploviklių, skalbiklių) ir maisto pramonėje naudojamų priedų (acto, citrinos rūgščių, sodos) fitotoksiškumo testus.

Kartais kaip pirminis oro užterštumo rodiklis naudojamas medžių žievės pH. Iš susmulkintos medžių žievės paruoštame substrate galima daiginti ir auginti sėjamąsias pipirnes. Reikėtų surinkti tos pačios rūšies ir panašaus amžiaus medžių, pvz., paprastosios eglės ar karpotojo beržo, žievės mėginių. Rinkti reikėtų kiek įmanoma panašesniu oru, geriau ne po intensyvaus lietaus. Dalis medžių turėtų augti užterštoje (šalia judrios miesto gatvės, geležinkelio ar trąšų gamyklos), o kita dalis – santykinai švarioje aplinkoje (mažiausiai 300 metrų atstumu nuo taršos šaltinių). Tokie tyrimai nesudėtingi ir jiems atlikti pakanka paprastų priemonių.

 Darbo priemonės

1. Sėjamosios pipirnės (Lepidium sativum) sėklos. Jų galima įsigyti sėklų parduotuvėse ar kitose prekybos vietose. Vienoje pakuotėje yra apie 5 g sėklų, o 1 g yra apie 400–500 sėklų. Tyrimams naudojamos sveikos, švarios, sausos neapdorotos sėklos.

2. Plastikinės arba stiklinės Petri lėkštelės. Lėkštelėse išdėliojama po 25 sėjamosios pipirnės sėklas 3 pav. parodyta arba kita tvarka. Svarbu, kad sėklos nebūtų labai arti viena kitos, t. y. užtektų vietos kiekvienai sėklai dygti ir augti. Vietoj Petri lėkštelių galima naudoti kitus vienodo skersmens (pvz., 9–10 cm) indus neaukštais kraštais (13–14 mm aukščio), kad neužstotų šviesos sudygusiems daigams.

3 pav. Sėjamosios pipirnės (Lepidium sativum) sėklų išdėliojimo Petri lėkštelėje tvarka. Nuotrauka autorės

3. Substratas: filtravimo popierius (4 pav.; tinka ir popieriniai rankšluosčiai) arba specialus substratas, pvz., smėlis, kompostas, medžių lapai, nuokritos, žievė, samanos. Popierius turi būti sausas, švarus, neužterštas cheminėmis medžiagomis, poringas, gerai sugerti vandenį, kad užtektų drėgmės sėkloms sudygti ir daigams augti. Substrato struktūra ir cheminė sudėtis priklauso nuo tyrimo tikslo.

4 pav. Sėjamosios pipirnės sėklos daiginamos (kairėje) ir daigai auginami (dešinėje) ant vandeniu drėkinamo filtravimo popieriaus. Nuotraukos autorės

4. Distiliuotas vanduo substratui drėkinti. Jei jo nėra, galima naudoti švarų vandenį iš čiaupo (vandens pH turi būti 6,0–7,5).

5. Matavimo švirkštas (matavimo cilindras, pipetė, stiklinė) vandens tūriui matuoti.

6. Indas vandeniui laikyti (laistoma apie 22 °C temperatūros vandeniu). 

7. Milimetrinė liniuotė.

8. Pincetas arba lazdelė sėkloms Petri lėkštelėse išdėlioti. 

9.  Etiketės ar specialus rašiklis Petri lėkštelėms žymėti.

Kaip atliekamas tyrimas

Labai svarbu tinkamai susiplanuoti tyrimą. Taršos ir fitotoksiškumo tyrimams pipirnės daiginamos ir auginamos vienodomis sąlygomis (temperatūra, apšvietimas, drėgmė). Turi skirtis tik daiginimo substratas (švarioje aplinkoje augusių medžių žievės substratas naudojamas kontrolei, o užterštoje aplinkoje – toksiškumui tirti) arba pipirnės daiginamos ant filtravimo popieriaus, tačiau kontrolinės laistomos distiliuotu vandeniu, o tiriamosios – medžių žievės ekstraktais. Vieno substrato toksiškumui įvertinti reikia mažiausiai 3, o dar geriau 5–7 Petri lėkštelių su pipirnės sėklomis. Tiek pat Petri lėkštelių reikia paruošti ir kontroliniam eksperimentui. Sėklų kiekis visose lėkštelėse turi būti vienodas, jos išdėstomos tokia pačia tvarka.

 Tyrimo eiga

1.   Paruošiamos Petri lėkštelės su substratu. Kaip tai padaryti, priklauso nuo substrato (filtravimo popierius, susmulkinta medžių žievė ir kt.). Jam sudrėkinti į visas Petri lėkšteles įpilama po 5–7 ml vandens. Tam tinka švarus plastikinis švirkštas ar matavimo pipetė, cilindras. Pipirnės sėklos daiginamos 48 val., todėl tikėtina, kad daugiau jų laistyti nereikės. Tačiau substratas visada turi būti drėgnas – sėkloms sudygti reikia vandens! Bet labai svarbu ir jo nepadauginti.

2.   Visose Petri lėkštelėse išdėliojama po 25 sėjamosios pipirnės sėklas. Jų reikėtų įsigyti daugiau, nes tyrimui būtina atrinkti iš pažiūros sveikas sėklas.

3.   Petri lėkštelės su sėklomis uždengiamos (uždengti reikėtų didesniąja lėkštelės dalimi) ir pažymimos: nurodomos tyrimo sąlygos ar jas reiškiantis simbolis ir lėkštelės numeris. Lėkštelės žymimos aiškiai, kad būtų galima lengvai atsekti kokiomis sąlygomis daiginti augalai. Šią informaciją ir eksperimento pradžios datą būtina registruoti, geriausia, kompiuteryje (pvz., A – 1; sėklų daiginimo sąlygos: 18–20 °C temperatūra, švarioje aplinkoje augusių medžių žievių substratas, 1 lėkštelė). Tyrimui paruoštas Petri lėkšteles galima nufotografuoti.

4.   Praėjus 48 val. vertinamas sėklų daigumas[4]. Suskaičiuojama, kiek kiekvienoje Petri lėkštelėje sudygo sėklų. Sudygusia laikoma sėkla su sveiku daigu (yra pagrindinės daigo dalys), iš kurios, numanoma, išaugs normalus augalas. Sėklos, kurios liko kietos, neišbrinkusios arba išbrinko vandenyje, tačiau daigas per tyrimui numatytą laiką neišaugo, laikomos nesudygusiomis (5 pav.). Sėklų daigumas procentais (x) apskaičiuojamas pagal formulę x = b/a × 100; čia a pradinis sėklų skaičius (šiuo atveju 25 sėklos), o b – sudygusių sėklų skaičius. Apskaičiuojamas kiekvienos Petri lėkštelės sėklų daigumas. Duomenys registruojami lentelėje, pvz., Excel programa.

5 pav. Sudygusios ir nesudygusios sėjamosios pipirnės sėklos. Nuotrauka autorės

5.   Įvertinus sėklų daigumą, Petri lėkštelės atidengiamos ir pipirnės tomis pačiomis sąlygomis auginamos dar 72 val. Tuo metu jos laistomos (visos lėkštelės vienodai) nedideliu kiekiu distiliuoto vandens, kad substratas neišdžiūtų. Praėjus 120 val. (penkioms paroms) nuo eksperimento pradžios, po vieną daigą dedama ant liniuotės ir matuojamas stiebo aukštis (matuojama tiesi, plona daigo stiebo dalis iki šaknies) ir šaknies ilgis (matuojama tiesi, pagrindinė šaknis iki galiuko; 6 pav.). Duomenys registruojami lentelėje. Šiam tyrimo etapui reikia nemažai laiko ir kruopštumo!

6 pav. Daigo stiebo aukščio (viršuje) ir šaknies ilgio (apačioje) matavimas. Nuotraukos autorės

6.    Kiekvienas daigas papildomai apžiūrimas, įvertinamas jo išsivystymas ir suskaičiuojama, kiek kiekvienoje lėkštelėje yra normalių daigų. Jais laikomi sveiki daigai (visos pagrindinės daigo dalys yra gerai išsivysčiusios, proporcingos ir sveikos), taip pat daigai su nežymiais trūkumais ir antrinės infekcijos pažeisti daigai (daigai, kuriuos būtų galima priskirti sveikiems daigams arba daigams su nežymiais trūkumais, jei nebūtų paveikti grybinės ar bakterinės infekcijos, atsiradusios ne dėl sėklos, bet kito infekcijos šaltinio). Nenormalūs daigai – tai silpni, pažeisti, neproporcingai išsivystę, neturintys kurios nors pagrindinės dalies ar supuvę daigai. Normalių daigų kiekis procentais (y) apskaičiuojamaspagal formulę y = c/d × 100; čia c – normaliai išsivysčiusių daigų skaičius lėkštelėje, o d – visi daigai lėkštelėje. Apskaičiuojamas normalių daigų kiekis (proc.) kiekvienoje Petri lėkštelėje ir duomenys registruojami lentelėje.